1.研究背景
酒糟含有大量的蛋白质、氨基酸、糖、纤维素、维生素及香味物质等。目前,其用途主要为直接作为饲料、制作调味品及培养食用菌等,其附加值低。如何使堆积如山的酒糟变废为宝,亟待解决。
酵母培养物,是一种新型绿色微生态制剂,指酵母菌在特定条件下发酵基质而制得的产品,主要由基质,酵母细胞及代谢产物组成。这些物质能促进动物肠胃微生物的生长,改善消化能力,提高免疫力、脱毒,因此有利于动物的健康生长,在畜禽生产中应用前景广阔。饲料行业需要大量的蛋白原料,我国每年进口万吨以上的大豆才能满足需要。黄酒糟富含蛋白质,但其营养价值不均衡、含水量高、直接饲喂利用率低,且常常堆积变质。利用酵母发酵黄酒糟,可作为一种很好的蛋白饲料来源,在一定程度上缓解蛋白饲料的压力。
1过程与方法
1.1材料,试剂及器材
材料:黄酒糟、酿酒酵母和糖化酶等。
YPD培养基:葡萄糖2%,胰蛋白胨2%,酵母浸粉1%,琼脂粉1.8%,灭菌℃、20min。使用前以入μg/mL添加氨苄青霉素,终浓度为μg/mL。
仪器:恒温水浴锅、恒温培养箱、洁净工作台、恒温摇床、显微镜、干燥箱等。
1.2种子液制备
称取适量干酵母于mL的三角瓶,以1:9(g:mL)加入以温度为38~42℃的蒸馏水,1%添加葡萄糖,封口,于38~42℃水浴15min,28~32℃水浴活化1h至起泡,即为活化好的酵母种子液。
1.3固态发酵工艺优化
新鲜黄酒糟于烘箱中45℃烘干,密封保存。用时取适量,根据实验设计添加一定比例的物质拌匀,每组设置3个平行,分别计数,求平均值。优化过程如下:
首先,对糖化酶添加量进行优化,起始发酵条件为:取20g干糟,加入罐头瓶中,水料比1:1,接种量1×CFU/g,糖化酶添加量分别为0、50、和U/g,自然pH,封口。培养30℃、72h,计算活菌数。其次,对装料量进行优化,在前一批优化的基础上,选择较优的糖化酶添加量U/g,装料量梯度分别为10,20,30,40和50g,其它条件不变。发酵结束后,计数活菌数。依次类推,分别对水料比(0.50,0.75,1.00,1.25和1.50),接种量(0.50×,1.00×,1.25×,1.50×和2.00×CFU/g),温度(25、28、30、32和35℃)和pH值(4.0,4.5,5.0,6.0和7.0)进行优化。
1.4酵母活菌计数
发酵结束后,将产物取出,平摊于报纸上,将粘结的发酵物切成大小基本一致的颗粒状,置于45℃鼓风干燥箱,每隔1h进行翻动1次,烘干。取10g于mL的三角瓶中,加入90mL蒸馏水,适量灭菌的玻璃珠,封口,30℃、r/min振荡30min。将三角瓶取出,静置20s,即为10-1稀释液。取该稀释液1mL,加入到9mL无菌水的中,摇匀成10-2稀释液,依次稀释至10-5-10-7,各取μL涂布于YPD平板,培养箱中30℃倒置培养2d后计数。
1.5酵母自溶(酵母培养物的制备)
发酵结束之后,往罐头瓶中加入45mL水、mg蛋白酶(50U/mg)和12mg的酵母破壁酶(U/mg),调节pH值为6.5,于50℃作用24h,45℃烘干。此时90%以上酵母细胞壁破裂,释放营养物质。
1.6成分分析
为了对比黄酒糟及酵母培养物的营养成分,分别测定粗蛋白、多肽、粗脂肪、还原糖、粗淀粉、粗纤维和灰分的含量。为评价可溶性蛋白的分子量分布,取1g干酒糟或酵母培养物溶解于10mL醋酸缓冲液中(0.05M,pH4.5),摇匀,沉淀10m,4℃、10,r/min离心10min,去掉沉淀,将上清通过0.2μm滤膜,用快速蛋白液相色谱仪(SuperdexTM75色谱柱)检测多肽及氨基酸。
2结果与讨论
2.1固态发酵工艺优化
酒糟中含有大量酵母无法利用的淀粉,糖化酶可以将淀粉降解成小分子的糖类。结果表明(图1),添加糖化酶效果显著,添加量为U/g时,活菌数达到稳定值为对照组的2.6倍,后略有降低,糖化酶价格较为昂贵,以U/g为较适添加量。
酒糟粘性较大,装料量过多,不利于通气和散热。反之,通气良好,但是水分蒸发过快。装料量低于30g时,酵母菌数随装料量的增加而增加,高于30g时,随着装料量的增加,反而对酵母生长产生相对抑制作用(图2)。故选择30g为较适装料量。
固态发酵,水分是一个关键因素。水分过高,基质密度大、不疏松,影响供氧。反之,水分蒸发过快。水料比低于1.25时,随着比值的增大,活菌数快速增加,比值超过1.25后,菌数略有下降(图3)。故水料水比以1.25为比较好。
接种量过大,不仅造成菌种资源的浪费,而且使得培养基内的水分相应偏高,基质粘连,不利于酵母生长。反之过低,致起始生物量低,降低增殖速度,延长发酵周期。
由图4知,接种量达1.25×后,活菌数增长缓慢,继续增加接种量,菌体增长受到抑制(图4)。故选取1.0×CFU/g作为较适接种量。在一定范围内,温度的升高有利于酵母的生长繁殖及代谢产物的产生,但是温度过高,导致酶类失活,甚至直接导致菌体死亡。反之,菌体生长缓慢,周期延长。由图5知,较适温度为30℃。
pH值是发酵过程中的重要参数,它通过影响菌体细胞膜的通透性,来改变酵母对营养物质的吸收,以及影响酵母自身酶系的活力。酿酒酵母的较适生长pH值为4.2~5.0,实验表明pH4.5为比较好(图6)。综上所述,以黄酒糟生产酵母培养物的比较好发酵工艺为:糖化酶U/g,装料量30g,水料比1.25,接种量1.0×CFU/g,温度30℃,pH4.5、此时发酵产物烘干后活菌数为20.88×亿/g。
2.2营养成分对比
经发酵后的酵母培养物,其蛋白及多肽含量增加,营养价值提高,具体为(表1):粗蛋白含量为46.55%,增加了10.77%;多肽含量为6.97,增加了3.03%;粗脂肪为9.51%,略提高了2.32%;还原糖含量为10.56%,大幅度增加了7.6%;粗淀粉含量为11.78%,大幅度降低了25.84%;粗纤维为4.46%,略降低了0.28%;灰分含量为4.57%,增加了1.76%。
如图7所示,黄酒糟经发酵,自溶制备成酵母培养物之后,酸溶性蛋白平均分子量降低,检测到更多的多肽和游离氨基酸。多肽和氨基酸是食品中的功能成分,具有抗氧化、抗菌、提高免疫力等多种功效。
目前,市场上的酵母培养物产品有:达威农公司的“益康XP”,粗蛋白12%,粗纤维6.50%,粗脂肪3%,灰分5%;安琪酵母有限公司生产的“酵母自溶粉FM”,粗蛋白含量约为40%,灰分12%;湖北高生生物饲料有限公司生产的“方祥益思特酵母培养物”,粗蛋白22.60%,多肽5%,粗纤维7.80%,灰分6.70%。本产品以黄酒糟为基质,在材料来源上与他们没有可比性,但其粗蛋白和多肽含量较高,酵母活菌数达20.88×亿/g。由此可见,黄酒糟生产酵母培养物具有一定的优势,深层次挖掘其发酵工艺,作为蛋白饲料和功能性饲料添加剂,其前景广阔。
3创新点
本实验的主要创新点如下:
(1)提出了酒糟利用的一种潜在的途径,制备酵母培养物,既可以作为饲料蛋白,又可以作为动物益生因子。单纯利用黄酒糟作为饲料蛋白,产品附加值低,只利用于黄酒糟富含蛋白质的特性。而作为酵母培养物,不仅可以使其蛋白质得到利用,而且使其功能发挥到,如多肽及氨基酸含量提高,酵母细胞内的代谢产物等益生因子释放得以利用。
(2)确定了比较好发酵工艺条件,糖化酶U/g,装料量30g,水料比1.25,接种量1.0×CFU/g,温度30℃,pH4.5,此时发酵产物烘干后活菌数为20.88×亿/g,蛋白质含量提高。与市场上酵母培养物产品相比,各有优势。
(3)固态发酵,酶解破壁工艺相结合,取长补短,相得益彰。通常,生产酵母培养物过程如下:液态发酵,厌氧酵母自溶,谷物吸附及烘干。此工艺周期长,需要长时间的厌氧条件细胞壁才裂解并释放营养物质,同时液态发酵能耗较高。而本工艺采用固态发酵富集菌体,简便易行;然后,采用廉价的常用酶类裂解酵母细胞壁,使代谢产物被释放出来,得到酵母培养物。
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